鸡传染性鼻炎河南株分离鉴定及防治

[目的]为了进行鸡传染性鼻炎河南株分离鉴定及防治的试验。[方法]从25个怀疑发生鸡传染性鼻炎的鸡场病料中分离到11株副鸡嗜血杆菌,经血清型鉴定A型8株,C型3株,对该鸡场进行病原分离鉴定、药敏试验、防治试验。[结果]用分离株研制的二价油乳剂灭活苗用于该病的预防和用分离株筛选的敏感药物用于治疗,效果均良好;用敏感药物给发病鸡饮水配合研制的二价油乳剂灭活苗给发病鸡紧急免疫接种,治疗鸡传染性鼻炎,效果更佳。[结论]该研究为制定鸡传染性鼻炎的防治措施提供了试验依据。     

副猪嗜血杆菌流行病学调查及两株分离株耐药性和致病性分析

为了解山东地区副猪嗜血杆菌病的流行情况和流行菌株的生物学特性及致病性,将2016-2018年山东省12个地区送检的103个发病猪的病料进行细菌分离,并对疑似菌株进行形态学观察、PCR鉴定及血清型鉴定,对两株流行菌株进行了培养特性观察、生化特性鉴定、药敏试验及致病性研究。最终分离获得29株副猪嗜血杆菌,分离率为28.16%,其中血清型4型和5型最为流行,其次是1型和12型。该病多发于春秋两季,31~50日龄的仔猪感染率最高。两株流行菌株LZ株和LC株均对青霉素类、头孢类等药物高度敏感,LZ株对庆大霉素、卡那霉素等中度敏感,对林可霉素、链霉素不敏感,LC株对庆大霉素、林可霉素等中度敏感,对卡那霉素、链霉素不敏感;生化特性试验结果显示,LC株和LZ株的硝酸盐还原试验、接触酶试验、葡萄糖发酵试验以及果糖发酵试验的结果均为阳性,吲哚试验、氧化酶试验、甘露醇发酵试验的结果均为阴性;动物致病性试验表明LZ株和LC株均具有较强的毒力,最小发病剂量分别为4.5×10^9 CFU和6.0×10^9 CFU。该研究为副猪嗜血杆菌病的防治提供了重要的参考依据。     

副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因的分段表达及其免疫原性分析

本研究旨在获得副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)转铁结合蛋白A基因(tbpA)的表达产物(TbpA),并对其免疫原性进行分析鉴定.采用生物信息学方法预测HPS的TbpA抗原表位,根据GenBank上发表的HPS(SH0165株)tbpA的核苷酸序列设计合成3对引物,用PCR从安徽省HPS分离株(LJ3) tbpA中分段扩增出tbpA1、tbpA2和tbpA3,并连接到pET-32a(+)载体上,经BamH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)中,进行IPTG诱导表达.利用SDS-PAGE检测目的蛋白,Western blotting分析重组蛋白的免疫活性;通过小鼠免疫攻毒保护试验和血清杀菌力试验,鉴定重组蛋白的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力.结果表明,从HPS(LJ3)tbpA中扩增出与预期设计的1140、897、666 bp大小相符的3个片段(tbpA1、tbpA2、tbpA3),扩增产物连接载体得到重组质粒,在大肠杆菌中实现表达,获得大小为62、54、44 ku的目的蛋白(rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3),均能与HPS阳性血清反应.rTbpA1与甲醛灭活菌体对小鼠免疫攻毒的保护率分别为20％和40％,但rTbpA1引起小鼠平均死亡时间显著延迟,兔抗rTbpA1与兔抗HPS(LJ3)血清具有同样显著的杀菌活性.结果显示,成功表达的rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3均具有良好的反应原性,其中rTbpA1更具有良好的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力,可望成为副猪嗜血杆菌病疫苗和血清学检测的候选成分.     

新疆北部部分地区副猪嗜血杆菌的ERIC-PCR指纹聚类分析

为了解新疆北部部分规模化养猪场副猪嗜血杆菌(H.parasuis)分离株的基因型,本实验采用ERIC-PCR方法结合统计学分析软件,对来源不同的12株H.parasuis进行分子指纹图谱分析.结果表明12株分离株分别位于4个聚类中,各个菌株之间的遗传距离较近,并且含有长度为1 000 bp的相同条带,相同血清型的分离株在其分子指纹聚类上均位于同一个分支中.试验结果表明基于ERIC-PCR的分子指纹聚类分析结合传统的琼脂免疫扩散法可以准确地对不同分离株H.parasuis进行分型.试验结果显示H.parasuis在该地区广泛存在并具有多种不同的基因型,同时为该地区H.parasuis的免疫防治提供了重要的实验依据.     

副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆、表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌的外膜蛋白ompP2基因,序列测定结果表明扩增片段全长1 188bp。将扩增片段插入表达载体pET-32a,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果证实重组融合蛋白约为60 000,West-ern-blot结果表明重组表达蛋白具有免疫反应性。以纯化的重组蛋白ompP2作为抗原,建立副猪嗜血杆菌的抗体间接ELISA检测方法。通过试验确定最佳反应条件为抗原包被质量浓度4.75mg/L,4℃包被过夜,待检血清的稀释浓度为1∶40,阳性判断标准为D630大于0.383。特异性和重复性试验表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,可用于副猪嗜血杆菌的检测。     

广西地区副猪嗜血杆菌ERIC-PCR指纹图谱分型研究

为探讨肠道细菌基因间重复序列(ERIC)的聚合酶链反应(PCR)技术用于副猪嗜血杆菌基因分型的可行性,对分离自广西地区不同猪场的22株副猪嗜血杆菌进行ERIC-PCR指纹图谱分型研究.结果发现,22株分离株显示出12种指纹图谱,可以区分无法进行血清分型的菌株.表明ERIC-PCR可适用于对副猪嗜血杆菌进行分子流行病学调...     

副猪嗜血杆菌菌影的制备

为研制副猪嗜血杆菌(H.parasuis)菌影疫苗,本实验通过PCR扩增噬菌体PhiX174的裂解基因E,将其连接到含有λPL/PR-cI857启动阻遏系统的pBV220载体中,使裂解基因E与λPL/PR-cI857串联成为温度敏感的裂解盒,构建重组质粒pBV-E。并将含有E基因的裂解盒插入pMD18-T载体中,构建H.parasuis打孔质粒(pMD-E)。采用电击穿孔法将其转入E.coliβ2155中,利用接合的方式将打孔质粒转入H.parasuis 5型菌株中。将含有打孔质粒的H.parasuis在28℃培养至对数生长期,升温到42℃诱导E基因表达,制备H.parasuis菌影。电镜观察菌影形态完整,内容物全部被释放到胞外。本实验为进一步研究菌影疫苗奠定了基础。     

Establishment of human lung infection model in vitro and mechanisms of NTHi-induced inflammatory responses

AIM: To investigate the key signal pathways of inflammatory responses in lung tissues induced by the infection of nontypeable Haemophilus influenzae(NTHi). METHODS: Human lung tissues were co-incubated with NTHi (10¹⁰ CFU/L) for 4 h and 24 h, respectively. The phosphorylation of p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) was detected by Western blotting. The nuclear translocation of nuclear factor (NF)-κB was examined by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). The expression of Toll-like receptor (TLR) 2 was measured by real-time quantitative RT-PCR, and the level of interleukin (IL)-8 was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, lung tissues were incubated with anti-TLR2 monoclonal antibody (5 mg/L), p38 MAPK inhibitor SB203580 (20 μmol/L), or NF-κB inhibitor PDTC (25 μmol/L) for 2 h, then stimulated with NTHi (10¹⁰ CFU/L) for another 24 h. The supernatants were collected for IL-8 detection. RESULTS: The TLR2-p38 MAPK-NF-κB signaling pathway in lung tissues was rapidly activated 4 h after NTHi stimulation. IL-8 secreted from lung tissues infected with NTHi was significantly increased compared with uninfected lungs (P<0.05). The pre-incubation with anti-TLR2 antibody, p38 MAPK inhibitor or NF-κB inhibitor markedly decreased IL-8 production induced by NTHi. CONCLUSION: NTHi induces inflammatory responses in lung tissues by activation of TLR2-p38 MAPK-NF-κB signaling pathway. Human lung infection model provides a new research tool for the study of interaction between pathogens and hosts.     

副猪嗜血杆菌毒力与非毒力菌株菌体蛋白的比较蛋白质组学分析

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是猪群上呼吸道的一种共栖菌群,在一定的条件下能侵入机体并导致严重的全身性疾病,区分出正常栖生菌株和致病性菌株是确诊该病的关键.为了筛选副猪嗜血杆菌毒力株与非毒力株之间的差异蛋白,本研究通过比较蛋白质组学分析临床分离的毒力菌株14A7-2和非毒力菌株20A3-2之间2-DE图谱的差异,提取两个菌株的菌体蛋白进行双向电泳分离,Imagemaster 2D Platinum 7.0软件分析处理凝胶图像,MALDI-TOF/MS鉴定差异蛋白.在副猪嗜血杆菌毒力菌株中检测到596±10个蛋白质点而在非毒力菌株中检测到568±10个蛋白点,其中表达量差异达5倍以上及毒力菌株或非毒力菌株特有的蛋白点共有80个.选取毒力菌株或非毒力菌株特有的44个差异蛋白点进行质谱鉴定,成功鉴定42个蛋白点,对应37种蛋白.其中,毒力菌株特有蛋白27种,非毒力菌株特有蛋白5种,在毒力菌株特有蛋白中鉴定出潜在毒力因子铁摄取调节蛋白、触发因子、3-脱氢奎尼酸脱水酶等.研究结果为进一步研究副猪嗜血杆菌的毒力因子和致病机理以及鉴别诊断不同毒力株新技术提供新信息.     

副猪嗜血杆菌云南流行毒株的分离与鉴定

[目的]了解云南省副猪嗜血杆菌流行毒株的生化特性。[方法]采集10头6月龄疑似猪传染性副猪嗜血杆菌病的病猪样品,用巧克力培养基进行细菌的分离与培养,并对分离菌株进行细菌的形态观察、培养特性和生化试验鉴定。[结果]成功分离出1株副猪嗜血杆菌,该分离株不需要X因子,但需要V因子。分离菌株被鉴定为副猪嗜血杆菌,从而将此病例确诊为副猪嗜血杆菌病。[结论]该研究可为进一步控制副猪嗜血杆菌的危害奠定基础。